Abbiamo già visto nell'articolo IL FUTURO DELL'ANALISI BIOINFORMATICA come una delle sfide maggiori nella progettazione del sequenziatore ideale sia quella di riuscire a produrre reads di lunghezza sempre maggiore. In questo senso, PacBio RS II sembra essere sulla strada giusta. PacBio RS è un sistema di Third Generation Sequencing e si propone come alternativa a Ion Torrent, Illumina e Roche. Mentre la lunghezza delle reads ottenibili con gli ultimi due non supera le centinaia di nucleotidi, PacBio RS II può produrre reads con una lunghezza media che va da 4.200 a 8.500 bp, fino ad un massimo di 30.000 bp.
Durante l'analisi bioinformatica dei dati del sequenziamento, il poter disporre di reads lunghe facilita enormemente l'operazione di alignment. Più una read è lunga, più la sua sequenza è specifica e più preciso è l'allineamento con le reference sequences più preciso. Al contrario, più una read è corta, più aumentano le probabilità che la sua sequenza possa essere allineata in modo aspecifico in diversi punti del genoma.
Per le sue caratteristiche, il sistema PacBio RS II sembra essere particolarmente adatto ai sequenziamenti de novo (assembly de novo di genomi di organismi vari). Il produttore riporta un tasso di accuratezza molto elevato (99,99%) e la capacità di identificare varianti con frequenza allelica anche molto bassa (addirittura inferiore allo 0,1%).
La tecnologia di sequenziamento adottata dal sistema pacBio RS II è detta SMRT sequencing (sigla brevettata che sta per Single Molecule Real-Time sequencing). In questo sistema il filamento di DNA da sequenziare viene ancorato, insieme ad una DNA polimerasi, sul fondo di una zero-mode waveguide (ZMW - una nanostruttura fotonica che è sostanzialmente un minuscolo tubo all'interno del quale è possibile rilevare cambiamenti infinitesimali di luce colorata). Il complesso DNA-polimerasi, ancorato sul fondo della ZMW, viene cimentato con una soluzione contenente i quattro nucleotidi (A, C, G e T) opportunamente marcati ciascuno con un fluorocromo diverso. La DNA polimerasi comincia ad incorporare i nucleotidi per costruire un filamento complementare a quello ancorato sul fondo. Man mano che la polimerasi incorpora un nucleotide, il fluorocromo del nucleotide viene rilasciato e l'apposito sistema di rilevazione registra l'evento luminoso associato. Il software di elaborazione rielabora quindi i segnali luminosi registrati fino a ricostruire la sequenza.
Ma non è tutto qui: il sistema PacBioRS II offre anche la possibilità di rilevare diversi fenomeni epigenetici (non solo la metilazione delle citosine, ma anche delle N6-metiladenine, delle N4-metilcitosine, nonché i danni da ossidazione del DNA).
Per quanto riguarda i passaggi di lavorazione in laboratorio, il sistema PacBio RS II (come del resto altri sistemi NGS) non richiede step di amplificazione successivi alla preparazione della sequencing library. I tempi di completamento del sequenziamento sono eccellenti: la casa dichiara un tempo di 8-10 ore.
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